来源：EFL生物3D打印与生物制造
心血管系统对脊椎动物至关重要，其提供的灌注功能在生物工程领域是一大挑战。目前，微流控和器官芯片系统虽在模拟血管流动和生物过程方面有进展，但制造材料多为塑料和弹性体，如聚二甲基硅氧烷（PDMS），这些材料存在诸多问题：比天然组织硬很多，会吸收培养基中的亲脂性生物分子，制造需光刻技术和洁净室，细胞难以将其重塑为更复杂结构，且仅适用于体外实验。此外，基于水凝胶材料构建灌注支架时，现有3D打印技术也存在局限，如分辨率、材料选择、细胞和材料空间图案化等方面的问题，限制了模型系统的结构复杂性和功能。
来自卡内基梅隆大学和匹兹堡大学的Daniel J. Shiwarski教授与Adam W.
Feinberg教授团队合作开展研究。他们利用自由形式可逆嵌入悬浮水凝胶（FRESH）3D打印技术，将细胞、胶原蛋白等生物材料打印成基于胶原蛋白的高分辨率内部可灌注支架（CHIPS），并开发了血管和灌注器官芯片反应器（VAPOR）。通过这种方式，成功实现了对结构和成分的精确控制，构建出复杂的组织工程平台。相关工作以“3D
bioprinting of collagen-based high-resolution internally perfusable
scaffolds for engineering fully biologic tissue systems”为题发表在《Science
Advances》上，为疾病建模和细胞替代疗法等研究提供了新的平台和思路。
1.
FRESH打印CHIPS的制备、3D测量及灌注，通过设计CAD模型，利用FRESH技术将生物材料打印到明胶微粒浆液支撑浴中，之后用光学相干断层扫描（OCT）成像和3D测量评估打印精度，再手动灌注蓝色染料测试通道通畅性。研究对象为多种CHIPS设计，包括蛇形、三通道和堆叠通道等。结果表明，该技术能实现高精度打印，挤出特征和负空间误差小，打印的CHIPS具有良好的保真度，可制作多种复杂内部通道结构，且能成功灌注，展示了该技术在构建可灌注支架方面的有效性。
2.
VAPOR生物反应器平台的设计与应用，运用CAD设计VAPOR生物反应器，采用3D打印技术制作其部件，通过连接蠕动泵、介质储液器等搭建灌注系统，并将CHIPS置于其中进行灌注实验。研究了不同设计的CHIPS在VAPOR中的灌注情况，如蛇形通道CHIPS的层流和脉动灌注、多层和螺旋通道CHIPS的灌注效果。结果显示，VAPOR能与CHIPS紧密配合，实现稳定灌注，不同CHIPS设计在VAPOR中展现出多样的流体行为，证明了VAPOR平台在支持CHIPS灌注研究方面的可靠性和有效性。
3. VAPOR灌注FRESH CHIPS，借助搭建的VAPOR灌注系统，对不同结构的FRESH
CHIPS进行灌注实验，通过在灌注液中添加染料观察流体流动状态，利用OCT成像分析通道情况，采用比色分析等方法研究流体混合效果。研究对象包括蛇形、堆叠和螺旋通道CHIPS。结果表明，在VAPOR中，不同CHIPS能实现稳定的流体灌注，如蛇形通道可实现层流和脉动灌注下的流体混合，多层和螺旋通道CHIPS可展示流体扩散等现象，证实了VAPOR对不同结构CHIPS灌注研究的适用性。
4. FRESH
CHIPS内扩散性的表征，设计双平行通道CHIPS，使用FRESH技术打印后，在VAPOR中灌注不同分子量的荧光标记葡聚糖，利用荧光显微镜进行时间序列成像，并通过分光光度分析检测灌注液中葡聚糖含量。研究不同分子量分子在CHIPS内的扩散情况。结果显示，分子在CHIPS内的扩散具有分子量依赖性，较小分子量的葡聚糖扩散速度更快；增加压力可促进较大分子量葡聚糖的扩散，表明CHIPS有利于分子扩散，为研究生物分子在组织工程支架中的传输提供了依据。
5.
多材料FRESH打印实现ECM组成、材料特性和生长因子的空间定义，开发多材料3D打印机和双相机光学针校准系统，使用该系统在平行板CHIPS中打印不同几何形状和刚度的胶原生物墨水，通过共聚焦显微镜观察打印效果。研究多材料FRESH打印在CHIPS中精确控制生物材料空间分布和特性的能力。结果表明，该技术能精确注册多个挤出机，实现多种生物材料的空间定位和不同ECM材料特性的图案化，且在多材料打印的双通道CHIPS中，细胞能成功黏附和生长，验证了该技术在构建复杂组织工程结构方面的潜力。
6.
多材料打印血管细胞生物墨水促进VAPOR灌注CHIPS内毛细血管样网络形成和增强VE-Cad表达，将含有血管内皮细胞（HUVECs）和间充质干细胞（MSCs）的纤维蛋白原基血管生物墨水与胶原蛋白通过多材料FRESH打印构建CHIPS，运用共聚焦显微镜、多光子和二次谐波成像技术观察细胞和结构变化。研究不同设计的细胞化CHIPS在静态培养和VAPOR灌注培养下的结构稳定性、细胞迁移和血管生成情况。结果显示，添加胶原壁可增强CHIPS稳定性，促进细胞迁移和VE-Cad表达，形成毛细血管样网络，且灌注能进一步促进这些过程，表明该方法在构建功能性血管化组织方面的有效性。
7.
FRESH打印血管化胰腺CHIPS展示血管生成和胰岛素分泌，将MIN6细胞、HUVECs和MSCs组成的胰腺样生物墨水通过多材料FRESH打印到双平行通道CHIPS中，进行静态和VAPOR灌注培养，使用免疫荧光染色、共聚焦显微镜观察细胞和结构变化，通过ELISA检测胰岛素分泌。研究胰腺样CHIPS在不同培养条件下的细胞行为、血管生成和胰岛素分泌功能。结果显示，灌注培养促进了细胞迁移、血管生成和胰岛素表达，且胰腺样CHIPS在葡萄糖刺激下能分泌胰岛素，其刺激指数高于静态培养，接近原代胰岛水平，证明了该模型在模拟胰腺功能方面的潜力。
研究结论
本研究开发的CHIPS和VAPOR平台，是3D生物打印技术的重大进展，它融合了高分辨率FRESH打印与动态灌注系统，能够构建复杂、功能性的厘米级组织构建体。该方法通过实现精确的3D多材料生物制造、直接的隔室细胞化、毛细血管样网络形成以及组织规模分泌功能的出现，突破了组织工程的现有界限。尽管仍面临一些挑战，比如优化微通道分辨率、增强流动条件下内皮细胞的稳定性以及改进体内整合等，但该系统的灵活性和可及性为其更广泛的应用和未来创新奠定了基础。从长远来看，完全生物支架的发展致力于为治疗应用构建功能性体积组织。虽然目前的CHIPS设计还需要针对体内植入进行调整，但通过优化胶原浓度、改变进出口结构等措施，有望实现更好的体内稳定性和功能。总之，该平台为疾病建模和细胞替代疗法提供了新的可能，推动了组织工程领域的发展。
文章来源：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adu5905
0 留言