来源：EFL生物3D打印与生物制造
天然聚合物（NP）水凝胶因与细胞外基质特性相似，是构建组织工程支架的理想材料，能为细胞生长提供适宜微环境，促进受损组织再生。然而，传统NP水凝胶存在诸多问题，其网络由高度水化的大分子链构成，交联弱且松散，在生理环境中会显著溶胀，导致分子链过度伸展、机械性能下降，限制了其在如骨软骨支架等结构组织工程中的应用。虽已有多种体系用于提升NP水凝胶机械性能，但大多含合成聚合物，会损害生物相容性和可降解性；且多通过弱非共价相互作用交联，在生理环境中易被削弱或破坏，致使过度溶胀和力学性能恶化
。
为解决这些难题，天津大学刘文广教授团队通过在水溶液中共聚甲基丙烯酸化明胶（GelMA）和甲基丙烯酸化丝素蛋白（SFMA），并经乙醇处理，制备出β片层增强的NP水凝胶（GelMA
- SFMA - AL）。该团队还利用EFL-BP86系列投影式光固化打印技术构建了双层骨软骨支架。相关工作以“3D printed β -
sheet - reinforced natural polymer hydrogel bilayer tissue engineering
scaffold”为题发表在《SCIENCE CHINA Technological Sciences》上，为骨软骨组织再生提供了新的解决方案。
1. GelMA -
SFMA水凝胶的制备及其作为3D打印双层水凝胶支架用于骨软骨修复，通过设计实验流程和构建模型的方法，研究了β片层增强天然聚合物水凝胶的制备过程及其用于构建3D打印双层骨软骨修复支架的可行性。先将甲基丙烯酸化明胶（GelMA）和甲基丙烯酸化丝素蛋白（SFMA）在水溶液中共聚，后经乙醇处理得到GelMA
- SFMA - AL水凝胶。利用数字光处理（DLP）3D打印技术，将载双氯芬酸钠（DS）的GelMA - SFMA -
AL作为顶层，载生物活性玻璃（BG）的作为底层构建双层支架。
2. 采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线衍射（XRD）分析方法，研究了GelMA - SFMA -
AL水凝胶在乙醇处理前后的化学结构和结晶特性变化。结果显示，乙醇处理后，水凝胶在FTIR光谱的酰胺I区域特征峰发生红移，β片层结构对应的特征峰增强，表明β片层含量显著增加；XRD图谱出现新的晶体峰，证实形成了疏水的丝II晶区。这表明乙醇处理可诱导水凝胶形成β片层结构，改变其内部结晶状态。
3. 乙醇处理前后GelMA -
SFMA水凝胶的力学性能，运用力学测试（拉伸、压缩及循环测试）的研究方法，对不同浓度GelMA和SFMA以及不同乙醇处理时间的GelMA -
SFMA水凝胶的力学性能进行研究。结果表明，乙醇处理能显著提升水凝胶的拉伸强度、韧性、压缩模量和强度。例如，经1小时乙醇处理的GelMA₁₀ -
SFMA₁₀ - AL水凝胶，其拉伸强度和韧性相较于未处理的GelMA₁₀ -
SFMA₁₀水凝胶大幅增加。而且，水凝胶在循环加载下具有良好的自恢复性，在接近人体步行频率范围内表现出稳定的弹性凝胶状态，其力学性能可通过调节聚合物浓度和乙醇处理时间进行大范围调控。
4. 水凝胶的相关性能表征，通过浸泡实验、降解实验和3D打印实验等研究方法，研究了GelMA - SFMA和GelMA - SFMA -
AL水凝胶的溶胀行为、降解性能和3D打印适用性。结果显示，乙醇处理后的水凝胶溶胀率和平衡含水量明显降低，在蛋白酶XIV作用下的降解速率显著减慢。同时，GelMA和SFMA的光交联特性使其溶液适用于DLP
3D打印，可制造出高分辨率、形状保真度高的结构，基于此制备的双层支架，顶层和底层具有不同的降解速率和模量，适用于骨软骨修复。
5. 采用力学性能测试、细胞毒性检测（MTT法）和细胞粘附实验等研究方法，对负载DS的GelMA - SFMA -
AL水凝胶进行研究。结果表明，负载DS会使水凝胶力学性能有所减弱，但仍能满足软骨再生的基本要求。细胞活力实验显示，4mg/mL
DS浓度下，大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）存活率较高。L929细胞在负载DS的水凝胶上能够良好粘附并增殖，说明该水凝胶在软骨再生方面具有应用潜力。
6. 利用力学测试、细胞培养实验和碱性磷酸酶（ALP）染色分析等研究方法，对负载BG的GelMA - SFMA -
AL水凝胶进行研究。结果表明，随着BG含量增加，水凝胶力学强度有所下降，但1%
BG负载量时仍保持较好的力学性能和细胞相容性。L929细胞在该水凝胶上能正常粘附和增殖，且rBMSCs在负载1%
BG的水凝胶上培养7天和14天后，ALP活性较高，说明其能有效促进rBMSCs的成骨分化，可作为骨软骨修复的底层材料。
7.
双层水凝胶支架的体外和体内生物学评价，借助细胞培养实验和动物实验的研究方法，对双层水凝胶支架的生物相容性和降解性能进行研究。体外实验中，rBMSCs在双层支架上生长良好，增殖速率较快，细胞能有效粘附并铺满支架表面。体内实验将支架植入SD大鼠皮下，结果显示，支架在14天出现明显降解，GelMA
- SFMA@DS/BG -
AL支架降解速率适中；H&E染色表明支架在体内引发的炎症反应较小，具有良好的组织相容性，这表明该双层支架在骨软骨组织再生方面具有应用前景。
研究结论
本研究通过共聚GelMA和SFMA，再经乙醇处理，成功制备出可生物降解且由β -
片层增强的天然聚合物水凝胶。研究表明，乙醇处理在共价交联网络中诱导形成的β - 片层晶区，可作为稳定的物理交联点，增强GelMA - SFMA -
AL水凝胶的机械性能，同时水凝胶网络中的化学交联能防止疏水β -
片层过度聚集，避免形成脆性水凝胶。经1小时乙醇处理可制得高强度且坚韧的天然聚合物水凝胶。利用DLP
3D打印技术构建的双层支架，顶层模拟关节软骨，底层模拟软骨下骨，该支架机械性能良好、降解速率适宜。体外实验显示其能支持细胞黏附和铺展，促进大鼠骨髓干细胞成骨分化；皮下植入实验表明该双层支架在骨软骨组织再生方面具有应用潜力。
文章来源：
https://doi.org/10.1007/s11431-023-2471-0
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