来源：EFL 生物3D打印制造与生物制造
关节软骨损伤（外伤或病变所致）易发展为骨关节炎并最终破坏关节，但现有手术、材料等治疗手段均难以恢复透明软骨的结构与功能。这一困境主要源于两方面：一是软骨本身细胞稀少、无血管，再生能力弱；二是传统组织工程支架仅复刻细胞外基质（ECM）宏观结构，忽视了细胞周基质（PCM）的关键作用，从而导致支架-间充质干细胞（MSCs）力学不匹配，修复组织常出现纤维化、肥大等问题。
研究显示，PCM是胚胎期软骨的初始基质，后续逐步形成PCM-ECM复合结构，其力学信号转导虽关联TRPV4等通路，但具体机制尚不明确。现有PCM模拟微凝胶研究已证实刚度可调控MSCs行为，但传统支架难以实现宏微观力学环境的协同匹配，而3D打印技术为此提供了核心解决方案。光固化3D打印生物支架（如GelMA支架），可精准构建适配关节缺损的宏观结构，同时作为载体高效整合类PCM单细胞微凝胶，搭建起微观仿生基质与宏观缺损修复的桥梁，弥补了传统材料无法兼顾局部力学稳态与整体结构支撑的缺陷。
论文题目：Developmental dynamics mimicking inversely engineered pericellular matrix for articular cartilage regeneration
DOI：10.1016/j.biomaterials.2024.123066
发表期刊：Biomaterials ( IF 12.9 )
本团队采用静电逐层包裹技术构建单细胞微凝胶，即通过明胶与透明质酸交替包裹大鼠滑膜间充质干细胞（SMSC）形成类PCM微环境，复现了软骨分化中胶原的时空表达；通过组学、生物力学测试等明确TRPV4为力学转导靶点及下游
YAP-TAZ/PI3K-AKT通路，将搭载该微凝胶的光固化支架用于动物软骨缺损模型，可维持宏微观力学稳定，有效抑制修复软骨的纤维化与肥大，为关节软骨临床修复提供了新方向（图1）。
图1 反向工程细胞周基质及其软骨再生应用示意图
主要内容
该图首先呈现了关节软骨的宏观层状结构及细胞周基质-细胞外基质的同心环状排列示意图，随后通过对E14.5大鼠胚胎膝关节的H&E、阿尔新蓝染色及胶原
II/VI免疫荧光染色，追溯到胚胎期已形成类PCM原始基质结构。通过对P1、P3、P7大鼠膝关节软骨表层、中间层、深层的胶原荧光定量分析，发现胶原
VI（PCM 组分）占比随软骨深度和出生天数增加而降低，胶原 II（ECM
组分）占比则呈升高趋势。结合生长板软骨的胶原I/II/VI/X免疫荧光染色结果，研究提出关节软骨存在胶原时空分泌特征，即胶原VI为软骨发育的初始基质，胶原II为软骨成熟进程中的基质（图2）。
图2 关节软骨中胶原的时空分泌特征
该图先展示了逐层单细胞微凝胶包裹的技术原理，即通过在带负电的大鼠滑膜间充质干细胞表面交替沉积明胶与透明质酸水凝胶，构建2层、4层、6层的包裹体系,验证了不同层数包裹的结构与细胞相容性。H&E验证了不同层数包裹的细胞均能保持单细胞独立性且细胞活性未受明显影响，TEM结果显示包裹层数增加会使细胞表面水凝胶厚度随之提升，SEM则表明4层和6层包裹体系可维持细胞形态且表面更光滑。zeta电位检测显示体系电位呈锯齿状波动且整体保持负电性，CCK-8实验证实各包裹组早期细胞增殖无显著差异（图3）。
图3 逐层单细胞包裹体系的表征
通过对不同层数包裹细胞的软骨分化诱导实验，发现4层包裹组的SOX9、ACAN等软骨分化核心基因表达显著高于其他组别，同时纤维化和肥大相关标志物表达水平更低。在细胞团培养体系中，4层包裹组经H&E、番红O等染色证实其基质积累和蛋白聚糖沉积量更多。免疫荧光染色结果显示，该组第7天有大量胶原VI作为初始基质分布，第14天胶原II在区域间基质逐渐富集，成功在体外模拟了胶原的时空分泌特征，且该组胶原I和X的表达强度显著低于未包裹细胞组，体现出其可抑制纤维化和肥大分化的优势（图4）。
图4 体外模拟胶原分泌的时空特征
借助组学分析锁定TRPV4为核心力学转导靶点，通过主成分分析明确了未包裹组与4层包裹组的转录组存在显著差异，筛选出441个上调基因和557个下调基因。KEGG富集分析显示差异基因富集于ECM-受体互作、钙信号通路、PI3K-Akt通路等通路，GO富集则关联到细胞外包裹结构组织、软骨细胞分化调控等生物学过程。基因表达热图表明4层包裹组的软骨相关基因和力学敏感钙通道基因TRPV4表达显著升高。结合小鼠器官发生时空转录组图谱分析，发现
TRPV4在软骨及软骨原基区域特异性富集，且YAP1与Akt家族基因表达模式相似，提示二者可能协同调控软骨发育（图5）。
图5 mRNA测序与空间转录组的联合分析
进一步通过微观力学测试与分子动力学模拟阐明TRPV4响应膜张力的门控机制。利用原子力显微镜检测不同层数包裹细胞的弹性模量，发现4层包裹组模量与胚胎软骨类PCM原始基质模量接近。通过膜张力荧光探针的荧光寿命成像，证实包裹层数增加可提升细胞膜张力。基于TRPV4的全原子分子动力学模拟显示，在一定膜张力范围内TRPV4的S6门通道可打开以介导钙离子内流，而膜张力过高则会导致通道关闭，该结果阐明了TRPV4响应膜张力的力学信号转导机制（图6）。
图6 微观力学表征及TRPV4响应膜张力的分子动力学模拟
验证了
TRPV4-YAP/TAZ-PI3K-Akt通路的调控作用，通过钙荧光成像证实4
层包裹组细胞内钙浓度高于未包裹组，PCR和免疫荧光实验显示4层包裹组TRPV4表达及膜定位更显著。利用
TRPV4激动剂处理未包裹细胞可提升其胞内钙浓度和软骨分化基因表达，而拮抗剂处理4层包裹细胞则会削弱其软骨分化能力。TRPV4-siRNA敲低实验结合蛋白印迹和PCR验证，证实4层包裹组可通过TRPV4调控下游
YAP/TAZ-PI3K-Akt通路，进而促进胶原时空表达并抑制纤维化等病理分化（图7）。
图7 TRPV4 介导的钙依赖性 YAP/TAZ-PI3K-Akt 通路激活
该图介绍了利用3D打印制备GelMA支架并搭载4层包裹细胞，用于大鼠关节软骨缺损修复的实验方案。大体观察和显微CT分析显示，12周时搭载4层包裹细胞的支架组缺损区修复效果更佳，其软骨下骨无过度增生现象。组织学染色结果表明该组软骨表面光滑、基质排列规整且蛋白聚糖沉积丰富，Mankin评分和ICRS评分均优于其他组别。免疫荧光染色证实该组修复区胶原II表达强度高且胶原VI呈细胞周分布，有效恢复了软骨的天然基质结构，同时胶原I表达较弱，体现出良好的抗纤维化修复效果（图8）。
图8 体内全层软骨缺损修复研究
未来展望
未来，3D打印技术或将成为该仿生周细胞基质（PCM）体系推动软骨再生的核心支撑。一方面，可升级3D打印生物墨水，将软骨分化关键因子（如TGF-β3）或天然脱细胞软骨基质与GelMA复合，通过打印实现成分梯度分布，匹配PCM微凝胶的力学信号，形成“力学-生化”双重调控，进一步定向诱导间充质干细胞（MSCs）软骨分化。另一方面，依托DLP生物3D打印技术，可精准复刻天然软骨“表层-深层”力学梯度与微孔网络，宏观上按患者缺损CT/MRI数据定制解剖形态支架，微观上构建微通道促进营养输送，解决传统支架适配性差、内部细胞缺氧问题。此外，还可通过3D打印集成导电模块，外接电刺激强化TRPV4-YAP/TAZ通路激活，或嵌入传感单元实时监测再生进程，推动“修复-监测”一体化，加速该体系临床转化。
0 留言